島津液相維修培訓班資料

流動相的選擇
? 采用 “HPLC” 級溶劑
? 避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑
? 對試樣有適宜的溶解度
? 溶劑粘度要小
? 與檢測器相匹配

水的選擇
? 水的等級
– 純化水（純化水中去除了無機和有機的污染物）
– 蒸餾水
– 去離子水（因為不純物的存在，去離子的吸光率較高）
? 溶劑的等級
– HPLC級（HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)）
– 優(yōu)級純（優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑）
– 分析純：都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒)

溶劑的過濾
濾膜類型：
l 聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。
l 醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶劑。
l 尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。
l 再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑

脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡
氣泡對測定的影響：
1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積
2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形
3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動
脫氣的目的：
1. 防止由氣泡的產(chǎn)生引起的故障
2. 防止由溶解（在液體中的）氣體量的變動引起的檢測不穩(wěn)定程度
1）示差折射率檢測器
*使折射率變化
2）UV檢測器（200nm以下）
*溶解氧氣有吸收
3）熒光檢測器
*溶解氧氣有消光作用
脫氣的方法
1. 超聲波脫氣法
2. He清除法
3. 使用氟樹脂膜的減壓脫氣法
梯度洗脫法
梯度洗脫裝置：
高壓梯度：用兩臺高壓將兩種溶劑輸入
低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓將流動相輸入到色譜柱中。
梯度洗脫：
優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度
梯度洗脫法的注意點
l 溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差
l 梯度混合的溶劑互溶性要好
l 梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）
l 查看空白實驗的數(shù)據(jù)。
l 遵守分析周期。（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）

樣品處理
1. 使用流動相溶解樣品
-- 減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時由為重要
-- 保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀
選擇緩沖液的步驟
1 .確定分離狀態(tài)時的流動相pH
2 .選擇具有與流動相的pH相近的pKa 的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強能力的緩沖液）
3 .確認檢測波長下緩沖液是否有大的吸收（在波長210nm附近進行檢測時，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）
pK1 pK2 pK3
醋酸 4.87
檸檬酸 3.13 4.76 6.40
磷酸 2.16 7.2 1 12.32

緩沖液的使用
l 使用前必須過濾
l 使用后一定要進行清洗 ，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用純水沖洗30-60min（1ml/min）
再用甲醇沖洗30min
l 易受到細菌和霉菌的影響

液相色譜容易出問題的部件
管線選擇
材料
l 不銹鋼
l Teflon
l PEEK (聚醚酮)
尺寸
l 0.1 mmI.D.x 1.6 mmO.D.
l 0.3 mmI.D.x 1.6 mmO.D.
l 0.5 mmI.D.x 1.6 mmO.D.
l 0.8 mmI.D.x 1.6 mmO.D.

? 不銹鋼 (可用于所有連接)
– 能承受幾千 kg/cm2 壓力
– 酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕, , , , (尤其在pH小于2時)
? PEEK (可用于所有連接)
– 能承受高達 250 kg/cm2壓力
– 可在整個PH范圍(pH 1-14)內(nèi)使用
– 不適用于高溶解性溶劑如氯仿等
? Teflon (用于柱后阻尼管、反應(yīng)管和排液管)
– 化學惰性大
– 能承受 5 kgf/cm2 壓力

吸濾頭
材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um
故障：堵塞
表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成
措施：用5％～20％的稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗
注意點：吸濾頭拆下時不必將塑料管剪斷

單向閥
故障1：寶石球粘附于墊片
表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通
措施：1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負壓，使寶石球與墊片分開
2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗
故障2：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好
表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大
措施：拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗

柱塞密封圈
故障：密封圈磨損而導(dǎo)致密封不良
現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或漏夜措施：更換密封圈
注意點：更換密封圈 拆卸泵頭前，柱塞桿復(fù)位（P－SET）

線路過濾器
故障：堵塞
現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力偏高
措施：5％稀硝酸，超聲波清洗
判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力>3kgf/cm2，則可能堵塞。

進樣器
l 自動進樣器
l 手動進樣器
原理：（六通閥）
注入方式：
1）全量注入
2）部分注入
手動進樣法
便捷的方法（不需清洗）
1.進樣狀態(tài)下插入微量注射器
2.切到裝填狀態(tài)
3.注入樣品
4.切回到進樣狀態(tài)

手動進樣器
操作注意點：
1）插針應(yīng)插到底
2）進樣應(yīng)使用液相色譜專用平頭進樣針
3）清洗應(yīng)使用專用針口清洗器

手動進樣閥
1、故障：轉(zhuǎn)子密封損壞
現(xiàn)象：漏液
原因：a 擰的太緊
b 樣品太臟
c 針頭損壞或不使用液相專用針
解決措施：更換轉(zhuǎn)子密封，并在使用

2、故障：載樣困難
原因：a 定量環(huán)堵塞
b 進樣器污染
解決措施：清洗或更換定量環(huán)、進樣器
柱子
故障：系統(tǒng)高壓、峰型變差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留時間的改變
解決措施：清洗
正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇
反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、異丙醇、0.05M稀硫酸

峰產(chǎn)生有肩或分叉的原因
1. 柱子劣化
（進口處產(chǎn)生不均勻的空隙）
2. 樣品劣化
（生成氧化物、分解物等）

判斷標準：所有的峰都產(chǎn)生有肩峰或分叉時則為柱子劣化

延長柱壽命方法：
l 倒沖柱
l 換過濾片
l 修補柱頭

分析柱的維護
1、在使用新柱之前，用強溶劑在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)沖洗 30 mins，長時間未用的分析柱也要同樣 處理
2、定期使用強溶劑沖洗柱子
3、使用緩沖鹽時，要先用水沖洗，再用有機溶劑沖洗
4、凈化樣品
5、分離條件
6、不使用時，要蓋上蓋子，避免固定相干枯
7、使用預(yù)柱
8、避免流動相組成及極性的劇烈變化
9、避免壓力脈沖的劇烈變化

ODS柱的使用注意點：
? 柱壓低于150kgf/cm2
? 柱溫在40℃左右，使用溫度為50℃
? 緩沖液PH使用范圍為2～7
? 流動相有機溶劑比例過低, 柱效下降快
硅膠在PH為3～4時穩(wěn)定性
堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。

更換氘燈（紫外檢測器）
判斷氘燈能量：設(shè)定220nm波長，檢查參比池能量，如能量低于800，需更換氘燈。
操作注意點：不要用手直接接觸氘燈表面
紫外檢測器
故障：樣品池受污
表現(xiàn)：樣品池和參比池能量相差較大
檢查方法：設(shè)定250nm波長，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如兩者相差較大，則樣品池受污。
措施：用針筒注入異丙醇，清洗樣品池；如污染嚴重， 拆開樣品池，將透鏡等放入異丙醇中超聲波清洗。

示差折光檢測器
l 原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣中各組分濃度。
l 優(yōu)點：通用型檢測器，
l 缺點：
1）對溫度變化敏感
2）對溶劑組成變化敏感，不能用于梯度檢測
3）屬于中等靈敏度的檢測器

液相色譜常見問題類型
A. 壓力異常（偏高、波動）
B. 峰形異常
C. 漏液

現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升
1、流速設(shè)定過高
2、保護柱或柱子篩板堵塞
3、流動相使用不當或有緩沖鹽析出
4、色譜柱選擇不當
5、進樣閥損壞
6、線路過濾器堵塞

現(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低
1、流速設(shè)定過低
2、色譜柱選擇不當
3、柱溫過高
4、系統(tǒng)漏液

現(xiàn)象：壓力波動
可能原因
1、泵頭中有氣泡
2、單向閥損壞
3、柱塞密封圈損壞
4、脫氣不充分
5、系統(tǒng)漏液
6、使用了梯度洗脫


漏液
接頭處漏液
1、接頭處松動
2、接頭磨損
3、接頭被污染
4、部件不匹配
泵漏液
1、單向閥松動
2、泵密封損壞
3、放空閥損壞
4、接頭松動（不要擰的太緊）
進樣閥漏液
可能原因
1、轉(zhuǎn)子密封損壞
2、定量環(huán)堵塞
3、進樣口密封松動
4、進樣針尺寸不合適
5、廢液管產(chǎn)生虹吸
6、廢液管堵塞
檢測器漏液
可能原因
1、流通池墊片損壞
2、流通池透鏡破碎
3、手緊接頭處漏液
4、進樣針尺寸不合適
5、廢液管堵塞
6、流通池堵塞
C. 保留時間漂移
保留時間漂移
可能原因
1、柱溫變化
2、流動相組分變化
3、色譜柱沒有平衡
4、流速變化
5、泵中有氣泡
6、流動相選擇不當
7、鍵合相流失
8、緩沖容量不夠
D. 基線問題（漂移、噪聲）

基線問題：
基線漂移
可能原因
1、溫度波動
2、流動相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑)
3、流通池被污染或有氣泡
4、流通池窗口破裂
5、流動相配比不當或流速變化
6、柱子平衡（約30－60min）
7、流動相污染，變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成
8、樣品中有強保留的物質(zhì)以饅頭樣峰被洗出
9、檢測器沒有設(shè)定在吸收波長處

基線噪聲（規(guī)則的）
可能原因
1、流動相、泵、檢測器中有氣泡
2、有地方漏液
3、流動相混和不均勻
4、溫度影響（檢測器和柱溫差別太大）
5、其他電子設(shè)備的影響

基線噪聲（不規(guī)則的）
可能原因
1、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成
2、有地方漏液
3、流動相各溶劑不相溶或混和不均勻
4、流通池污染
5、檢測池能量不足
6、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡

峰形異常：
前沿峰、拖尾峰
可能原因:
1、柱塞板堵塞
2、色譜柱塌陷
3、柱外效應(yīng)
4、干擾峰
5、緩沖不足或不合適
6、化學或次級保留（硅羥基效應(yīng)）
7、重金屬污染
8、樣品溶劑選擇不當
9、樣品過載
10、柱溫過低
分叉峰
可能原因:
1、保護柱或分析柱污染
2、樣品溶劑不溶于流動相
峰展寬
l 進樣體積過大
l 流動相粘度過高
l 檢測池體積過大
l 保留時間過長
l 柱外體積過大
l 樣品過載
峰變形
可能原因：
1、樣品過載
2、樣品溶劑選擇不當

鬼峰
1、進樣閥殘余峰
2、樣品中未知物
3、柱未平衡
4、水污染
5、三氧化