誘變育種的三個主要步驟:出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株

從自然界直接分離的菌種，發(fā)辭活力般是比較低的，不能達到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點，改良菌種。采用物理和化學因素促進其誘發(fā)突變，這種用人工的方法處理微生物，使它們發(fā)生突變的育種方式就是誘變育種，它是內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。

誘變育種具有其重要的意義，當今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)滋株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能，而且能改進產(chǎn)品的質(zhì)量、擴大品種數(shù)和簡化生產(chǎn)工藝等。誘變育種與其他育種方法相比，具有操作簡便、速度快和收效大的優(yōu)點。誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個主要步驟。

（1）選擇出發(fā)菌種

用來進行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌種，在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇會直接影響到后的誘變效果，因此必須對出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當?shù)牧私?，挑選出對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。具體方法是選取從自然界新分離的野生型菌株，它們對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下被馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株樣也容易達到較好的誘變效果；選取每次誘變處理都有定提高的菌襪，往往多次誘變效果可能疊加，另外，還可以同時選取2~3株出發(fā)菌株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。

（2）同步培養(yǎng)

在誘變育種中，處理材料般采用生理狀態(tài)致的單倍休、單核細胞，即菌懸液的細胞應盡可能達到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細菌般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)相對同步，比較容易變異，重復性較好。具體做法有兩類：類是通過環(huán)境條件來誘導同步性，例如變換溫度、光線，或向處于穩(wěn)定期的菌懸液中添加新鮮培養(yǎng)基；另類是用物理方法將同步生長中的細胞挑選出來，例如將非同步的細菌培養(yǎng)液通過大小不同的微孔過濾器，從而將大小不同的細胞分開，分別取濾液培養(yǎng)，就可獲得同步生長的細胞。

（3）制備單細胞或單孢子菌懸液

這步的關鍵是創(chuàng)備定濃度的、分散均勻的單細胞或單孢子懸液，為此要進行細胞的培養(yǎng)，并收集菌體、過濾或離心、洗滌，菌懸液般可用生理鹽水或緩沖溶液配創(chuàng)。如果是用化學誘變劑處理，因處理時pH會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或濾紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達90%以上，這樣可以保證懸液均勻地接觸誘變劑，獲得較好的誘變效果。后制得的菌悉液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度為10°~10°個/mL，放線菌和細蓄的濃度大約為10°個/mL。菌懸液的細胞可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，其中以平板計數(shù)法得到的結(jié)果較為準確。

（4）誘變處理

先選擇合適的誘變劑，然后確定其使用劑量。常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學誘變劑，常用的物理誘變劑有紫外線、X射線、y射線（如Co60等）、等離子、快中子、a射線、射線、超聲波等。常用的化學誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖啶類化合物等。

物理誘變劑中常用的是紫外線。由于紫外線不需要特殊的貴重設備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應用于工業(yè)育種。紫外線是波長短于紫色可見光而又接近紫色光的射線，素外線波長范圍雖寬，但有效范圍于個小區(qū)域，多種微生物敏感的波長集中在265nm處，對應于功率為15W的紫外燈。

紫外線輻射是種非電離輻射，當物質(zhì)吸收定能量的紫外線后，其中的某些電子被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會被激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學變化。脫氧核糖核酸能吸收大量紫外線，容易受紫外線的影響而發(fā)生變化，因此紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)的變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用，化學誘變劑的種類很多，根據(jù)它們對DNA的作用機制，可以分為三大類。類是烷化劑，它與個或多個核酸堿基發(fā)生化學變化，引發(fā)DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而導致變異，例如硫酸二乙酯、亞硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N'-亞硝基服等。二類是些堿基類似物，它們通過代謝作用滲人DNA分子中而引起變異，例如5溴尿密啶、5氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8氮的嘌呤等。第三類是曠啶類，它造成TDNA分子增加或減少1~2個堿基，從而引起堿基突變點以后的全部遺傳密碼在轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生錯誤。選擇化學誘變劑時應注意：亞硝胺和烷化劑應用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多，其中亞確基服和甲基磺酸乙酯被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性小的誘變劑中的員；堿基類似物和羥胺雖然具有很高的特異性，但很少使用，因為其回復突變率高，效果不大。誘導劑的劑量選擇也是個關鍵的問題，決定化學誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間?；瘜W誘變劑的處理濃度常用每毫升幾微克至幾毫克，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，還受水解產(chǎn)物的濃度、些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。對于種化學誘變劑，處理濃度對不同微生物般有個大致范圍，在進行預試驗時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑。這里需要說明的是化學誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后要有合適的終止反應方法，般采用稀釋法、使用解毒劑或改變pH等方法來終止反應。要確定個合適的劑量，酒常要經(jīng)過多次試驗，就般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降，根據(jù)對縈外線、X射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中，而負突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。

在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種誘變劑復合處理的辦法。復合處理方法主要有三類：類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同種誘變劑的重復使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用，如果能使用不同作用機制的誘變劑來做復合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復合處理常呈現(xiàn)定的協(xié)同效應，這對誘變育種的工作是很有份值的。

（5）篩選變異菌株

菌種經(jīng)誘導處理后，絕大多數(shù)是負突變株，篩選的目標是通過盡可能少的工作，將誘導后可能出現(xiàn)的正突變株從大量的突變中分離鑒定出來。怎樣設計才能花費較少的工作量達到好的效果，這是篩選工作中的條原則。般采用簡化方法，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用培養(yǎng)皿反應直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。培養(yǎng)皿反應是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出定的生理效應，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。

（6）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選及應用有著十分重要的意義。營養(yǎng)缺陷型菌株不僅在生產(chǎn)中可直接作為發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等中間產(chǎn)物的生產(chǎn)菌，而且在科學實驗中也是研究代謝途徑的好材料和研究雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、原生質(zhì)體融合等遺傳規(guī)律的遺傳標記菌種。

營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等）的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株.其變異前的菌株稱為野生鹵株。凡是能滿足野生菌株正常生長的低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基（MM）。在基本培養(yǎng)基中加入些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酵母膏等，形成能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為培養(yǎng)基（CM）。在基本培養(yǎng)基中只是有針對性地加入某種或某幾種自身不能合成的有機營養(yǎng)成分，形成能滿足相應的營養(yǎng)缺陷型菌襪生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基（SM）。

營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌襪、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。

誘變劑處理時與其他誘變處理基本相同，在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型菌株的比例般很低，通常只有百分之幾至干分之幾，采用抗生素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株的目的，抗生素法是利用野生型菌株能在基本培養(yǎng)基中生長，而缺陷型菌株不能生長，于是將誘變處理液在基本培養(yǎng)基中短時培養(yǎng)讓野牛型菌株生長，使其處于活化階段，而缺陷型菌株無法牛長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時加入定量的抗生素，活化狀態(tài)的野生型菌株就被殺死，保存了缺陷型菌株，在選擇抗生素時，細菌可以用，酵母可用，菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中野生型菌株的孢了能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型菌株則不能，因此，將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)段時間后，再進行過濾，如此重復數(shù)次后，就可以除去大部分野生烈菌株，同樣達到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型菌株的目的。營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法很多，主要有影印法、夾層培養(yǎng)法、逐個檢出法、補充培養(yǎng)法等四種。

影印法是將誘變處理后的細胞涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落，然后用小塊直徑比培養(yǎng)皿稍小的圓柱形木塊覆蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來，在絲絨上輕輕按下，轉(zhuǎn)接到另基本培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個培養(yǎng)皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前平板上某部位長有菌落，而在后培養(yǎng)基上的相應部位卻沒有，就說明這是個營養(yǎng)缺陷型菌落。

夾層培養(yǎng)法是先在培養(yǎng)皿上倒層基本培養(yǎng)基，冷凝后加上層含菌液的基本培養(yǎng)基，凝固后再澆上薄層的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，在皿底對先出現(xiàn)的菌落做標記，然后倒上薄層培養(yǎng)基（或補充培養(yǎng)基），再培養(yǎng)，這時再出現(xiàn)的新菌落多數(shù)即為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點是結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不容易。

逐個檢出法是將經(jīng)過誘變處理的細胞涂布在培養(yǎng)基平板上，待長出單個鹵落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在培養(yǎng)基上長出菌落而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是個營養(yǎng)缺陷型菌株。

補充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細胞接種在含有微量（0.01%以下）蛋白陳的基本培養(yǎng)基上，野生型菌株會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微的相應物質(zhì)。

確定生長譜是指采用上法透出的缺陷型菌株經(jīng)幾次驗證確定后，還需確定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，還是維生素缺陷型，或是嘌呤、密啶缺陷型。生長譜測定可以用兩種方法。種是將缺陷型菌株培養(yǎng)后收集菌體，制備成細胞懸液后，與基本培養(yǎng)基（熔化并冷卻至50℃）混合并傾注培養(yǎng)皿，待凝固后，分別在培養(yǎng)皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后會在組合區(qū)長出菌落，就可測得所需營養(yǎng)。另種方法是以不同組合的營養(yǎng)混合物與熔化并冷卻至50℃的基本培養(yǎng)基鋪成培養(yǎng)皿，然后在這些培養(yǎng)皿上劃線接種各個峽陷型菌襪于相應位置，培養(yǎng)后根據(jù)常株的生長狀況推知其營養(yǎng)因子。