英文名稱：

SPE-Ti-IMAC, 99%

中文名稱：

固相萃取固定化親和色譜微球

保存條件：

室溫儲存，保質(zhì)期為五年。

適用范圍：

本產(chǎn)品適用于對磷酸肽的鑒定和富集。

自備材料：

•樣品：蛋白酶解液

注意：蛋白酶解液中不能含有干擾磷酸肽富集的物質(zhì)，如 EDTA等絡(luò)合劑、含磷酸根的緩沖鹽！

•Loading buffer：80%ACN / 6%TFA水溶液

作用：將酶解液酸化，高濃度的 TFA-可以抑制酸性肽段的殘留

•Wash buffer 1: 50%ACN / 6%TFA / 200 mM NaCl水溶液

作用：洗滌非特異性吸附的肽段，鹽可以抑制非磷酸肽的殘留。

•Wash buffer 2：30%ACN / 0.1%TFA水溶液

作用：洗滌殘留的 Wash buffer1中的鹽。

•Elution buffer：10%氨水溶液

•耗材：200 μL槍頭、600 μl離心管、1.5 ml離心管、直徑為 1 mm的篩板

•Tip柱準(zhǔn)備：

(1)將 1 mm的篩板填入 200 μL槍頭中，如圖 1a-b所示，盡可能填的靠近槍頭的底端。

圖 1

(2)如圖 2所示，將 600 μL離心管剪開，在離心管蓋中間打孔，使 200 μL槍頭可以卡在圖 1c所示位置；

如圖 2

(3)如圖 1d所示，1 mL離心管剪掉蓋子作為套管，然后在 200 μL的槍頭中加入適量已螯合 Ti⁴⁺的 SPE-Ti-IMAC材料，Tip柱制作完成，如圖 3所示。

如圖 3

注意事項：

本產(chǎn)品 SPE-Ti-IMAC材料未螯合 Ti⁴⁺，首先應(yīng)先將 Ti⁴⁺螯合到材料上，然后再進行磷酸肽富集。

200 μl槍頭一般建議最多裝 10 mg SPE-Ti-IMAC材料，如果樣品起始量較大，請按比例增加 SPE-Ti-IMAC材料使用量。當(dāng)材料使用量為 100 mg以下，可以使用柱管體積為 1 ml的 SPE柱管及其對應(yīng)篩板；當(dāng)材料用量為 100-200 mg時，可使用柱管體積為 3 ml左右的 SPE柱管及其對應(yīng)篩板。

實驗步驟：

一、 SPE-Ti-IMAC材料的 Ti⁴⁺螯合

1、按照 SPE-Ti-IMAC材料:硫酸鈦 Ti(SO₄)₂ = 1:50 (m/m)，稱取材料和硫酸鈦。以稱取500 mg材料為例，將 25 g硫酸鈦固體加入 50 mL平底離心管中，加入純凈水至 40 ml，超聲溶解 (注意：硫酸鈦在溶解過程中會放熱，請緩慢加入)。向硫酸鈦溶液中加入 SPE-Ti-IMAC材料，混勻，置于 Rolling Incubator上搖勻，室溫過夜，請勿磁力攪拌。

注意：可按照實際制備情況酌情稱取材料和硫酸鈦，建議 SPE-Ti-IMAC材料不要低于 500mg。

2、次日，將步驟 1中的 SPE-Ti-IMAC材料靜置至其沉到離心管底部，棄上清。

3、加入適量 0.1% TFA水溶液將 SPE-Ti-IMAC材料分散，混勻，靜置至其沉到離心管底部，棄上清。

4、重復(fù)步驟 3，洗 5-6次左右，目的是盡量去除未螯合的 Ti⁴⁺。

5、加入 200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液洗滌 SPE-Ti-IMAC材料 2次。

6、加入 0.1% TFA水溶液洗滌 2次，均勻轉(zhuǎn)移至離心管中，可根據(jù)實驗需求將 SPE-Ti-IMAC材料分散成不同的濃度(如 100 mg/ml或 10 mg/ml)，于 4℃保存。

7、檢測 SPE-Ti-IMAC材料是否成功螯合 Ti⁴⁺：取 100 μL次洗滌的上清液，加入100 μL 30% H₂O₂(市售雙氧水原液)中，若溶液不變色，說明螯合后的 SPE-Ti-IMAC材料已經(jīng)洗干凈。若溶液變色，則繼續(xù)洗滌。同時，可取少量 SPE-Ti-IMAC材料，加入 100 μL 30% H₂O₂中，若材料呈現(xiàn)明顯黃色，說明 Ti⁴⁺螯合的 SPE-Ti-IMAC材料制備成功，可用于后續(xù)磷酸肽富集。

注意：上述 3-6步驟為 SPE-Ti-IMAC材料的洗滌，主要目的是洗滌未螯合的 Ti⁴⁺，請勿省略。

二、Tip (SPE)法富集磷酸化肽

1、蛋白酶解液與 Loading buffer按體積比 1:1均勻混合，SPE-Ti-IMAC：蛋白酶解液=20:1-30:1(m/m)均勻混合。以下以 250 μg蛋白酶解液，SPE-Ti-IMAC材料：蛋白酶解液=20:1為例。

注意：Loading buffer一定要足量，保證 TFA終濃度≥3%；因 SPE-Ti-IMAC材料在 Ti⁴⁺螯合過程中會略有損失，建議根據(jù)實驗具體情況，自行優(yōu)化材料與樣品的使用比例，以達到使用效果！

2、向 5 mg Ti⁴⁺螯合的 SPE-Ti-IMAC Tip柱中加入 200 μL 0.1%TFA，清洗材料。

3、250 μL蛋白酶解液(1 μg/μL)與 Loading buffer按體積比 1:1充分混合，加入到 Tip柱中進行富集，總時間控制在 20 min左右。

4、加入 200 μL Wash buffer 1洗滌，除去非特異性吸附，重復(fù) 1次，總時間控制在 10 min左右。

5、加入 200 μL Wash buffer 2洗滌 1次，除去上述步驟中殘留的鹽，時間控制在 5 min左右。

6、加入 200 μL Elution buffer洗脫 2次，合并洗脫液，即富集好的磷酸肽，總時間控制在 15 min左右。

7、洗脫的樣品在凍干機中凍干，于-20℃保存，質(zhì)譜分析時需用 1% FA復(fù)溶。

注意：Tip法富集磷酸化肽一般通過離心的方式進行，一是為了更好的控制液體從 Tip中的流出速度(以上述 5 mg SPE-Ti-IMAC Tip柱為例，上樣和洗脫的過程離心力一般控制在 80-100 g，洗滌過程控制在 200 g)，二是可以保證條件的一致，從而保證結(jié)果的重現(xiàn)性。上述 2-5步驟中的時間為離心時間。